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TUhjnbcbe - 2022/4/13 18:25:00
(本文约字,阅读时间约9分钟)

摘要:

本研究旨在研究不同免疫抗体水平下H9亚型AIV的排*规律。选取SPF鸡进行H9N2灭活疫苗免疫,根据HI效价将鸡群分成高、中、低三组,攻*后分析其排*差异。结果发现:抗体水平为9.44log2时,个别鸡只仍会感染排*,且抗体水平越低,感染排*鸡只数量越多;当抗体水平达到11log2时,鸡群不再排*。

关键词:

禽流感病*;H9亚型;不同免疫抗体水平;排*规律;

疫苗免疫是控制H9亚型AIV的有效措施[1]。但由于疫苗质量、免疫程序、营养、机体本身等各种因素易造成免疫失败,使AIV的发生呈现越来越多的非典型性,给诊断、预防带来极大困难[2,3]。同时,随着免疫压力的增加,H9亚型流感病*出现了新的特征,高抗体水平条件下仍然出现H9亚型禽流感病*感染,鸡胚接种试验发现H9亚型野外分离*株的致病力明显增强[4,5]。因此,在对AIV流行株进行监测的同时,有必要对不同抗体水平状态下的鸡群感染H9后的排*规律进行研究,从而对H9亚型AIV的科学防控具有重要指导意义。

1材料与方法

1.1*株

H9亚型AIV:本实验室分离保存,命名为CJ。

1.2试验动物及主要试剂

SPF鸡、10日龄SPF鸡胚,由山东昊泰实验动物繁育中心提供;10%的甘油PBS(含双抗U/mL);反转录酶(M-MLV),Promega公司产品;Trizol试剂,Invitrogen公司产品。

1.3

不同免疫抗体水平下H9亚型AIV的排*规律研究

SPF鸡7d时免疫H9N2灭活疫苗,肌肉注射,0.6mL/只,带翅号;14d时选取一部分鸡只进行二次免疫,定期进行H9抗体效价测定,根据HI效价将鸡群分成3组:HI效价为6~7log2的确定为1组,即低抗体组(6.44log2);HI效价为8~10log2的确定为2组,即中抗体组(9.44log2);HI效价为11log2的确定为3组,即高抗体组(11log2),隔离器分开饲养。另设非免疫组作为对照组,每组9只。将H9亚型AIV*株(CJ)作1:10稀释,每只1.0mL点眼滴鼻。攻*后每隔24h采集一次泄殖腔棉拭子,连续采集10d,将采集的棉拭子放入装有10%的甘油PBS(含双抗U/ml)的离心管中,-80℃保存备用。

1.4病*分离及RT-PCR方法检测

将采集的棉拭子高速离心,取上清,接种10日龄SPF鸡胚,每管接种2枚,0.2mL/枚,另设生理盐水对照。37℃温箱培养,观察4d,记录结果,收取活胚尿囊液进行血凝试验,同时进行常规RT-PCR方法复核检测。

1.5分离*HA基因测序分析

选取几个代表组不同时间点的分离*及攻*用*株,进行HA基因的扩增、克隆及测序,进一步分析攻*后不同时间的排*在序列上的差异。

2结果

2.1

不同HI抗体水平状态下H9亚型AIV的排*情况分析

将病*分离和RT-PCR检测均为阳性者判定为排*,1组鸡群从第2天开始排*,持续至第5天,6~7d时不再排*,但第8天又出现排*。2组鸡群第2天时只有1只排*,之后不再排*,直到第9天时又出现鸡只排*。3组没有排*现象。详细结果见表1。

2.2部分分离*HA基因测序分析

为进一步分析上述排*现象,选取2组感染H9亚型AIV2d(2组-2d)和9d(2组-9d)以及对照组8d(对照-8d)泄殖腔棉拭子分离*、攻*用*株,进行HA基因的扩增、克隆及测序分析。结果发现,2组免疫鸡群感染H9亚型AIV2d和9d的分离*两者HA基因的氨基酸序列相似性为98.5%,两者与攻*株HA基因的氨基酸序列相似性分别为96.8%和97%(表2)。

3讨论与分析

3.1

在普遍使用H9N2亚型禽流感灭活疫苗的强大免疫压力下,H9N2病*变异加快,出现了多个基因亚型的H9N2亚型禽流感流行*株,虽然H9N2亚型AIV发生了一定变异,现有疫苗已不能提供完全保护,除考虑流行*株外,应制定合理的免疫程序,这就需要定期进行抗体监测和评估,本试验就是为探讨不同抗体水平下H9的排*情况,进而确定抗体水平与免疫保护之间的关系。

3.2

从表1和表2可以看出,抗体水平为6.44log2的试验鸡排*数量多、持续时间长,表明该抗体水平不能有效抵抗H9亚型AIV的攻击。抗体水平达到11log2时,鸡群泄殖腔中未分离到病*,表明鸡群不再排*。抗体水平为9.44log2时,鸡群攻*后2d时只有一只鸡泄殖腔能分离到病*,而9d时又出现一只鸡泄殖腔分离到病*。为进一步确定攻*后9d时分离*的来源,我们对这两个时间点的病*进行了HA基因测序分析,两者氨基酸序列相似性高达98.5%,表明9d排*鸡只可能又被同一鸡群中排*鸡只感染所致。因此,实际生产过程中应定期进行流行*株的抗体监测,尽量保证鸡群处于高抗体水平,才能有效抵御疾病风险。

盛媛,魏秀丽,徐恩民,刘娜,吴静,艾武,宋敏训,王林,马秀丽.不同免疫抗体水平下H_9亚型AIV的排*规律研究[J].家禽科学,(12):5-7.

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